爪蟾卵母细胞电生理(用爪蟾卵母细胞做实验的三个原因)

在生活中，很多人可能想了解和弄清楚爪蟾卵母细胞中电压钳检测通道蛋白和受体蛋白电流变化服务的相关问题？那么关于爪蟾卵母细胞电生理的答案我来给大家详细解答下。

电压钳（voltageclamp）又叫电压钳制或电压固定，该技术由Cole和Marment设计，后经Hodgkin和Huxley改进并成功地应用于神经纤维动作电位的研究。

其设计原理是根据离子作跨膜移动时形成了跨膜离子电流（I），而通透性即离子通过膜的难易程度，其膜电阻（R）的倒数，也就是膜电导（G）。因此，膜对某种离子通透性增大时，实际上时膜电阻变小，即膜对该离子的电导加大。根据欧姆定律V=IR，即I=V/R=VG，所以，只要固定膜两侧电位差（V）时，测出的跨膜电流（I）的变化，就可作为膜电导变化的度量，即可了解膜通透性的改变情况。

目前电压钳技术在爪蟾卵母细胞中应用得非常成熟，成为研究各种离子通道蛋白或者转运体蛋白的重要技术，其中水通道蛋白、K离子通道蛋白、Na离子通道蛋白、以及一些气味受体均可用此技术进行机制研究。

卵母细胞表达体系优点：

异源表达其他物种通道蛋白，不受其他物种另外蛋白以及电源的影响，利于单独研究此蛋白功能；爪蟾卵母细胞量多且获得率高，爪蟾也不需处死，可以反复使用；卵母细胞体外培养方法简单，且可以异源表达其他各类物种的基因；表达简单，不用像其他动物、植物物种需要进行载体转化，直接注射RNA进入卵母细胞的细胞质中即可表达；卵母细胞体积大，本身离子通道较少，对研究影响较小；

下 面给大家介绍我们做过的2种电压钳实验：K离子通道研究以及气味受体研究。

1.载体构建

注入爪蟾卵母细胞中的是目标基因的RNA，因此需要我们在体外合成RNA。我们需要构建载体，进行体外cRNA合成实验，载体有多种，常见的有pNB1、pGEMHE等，此类载体通常会融合表达GFP、mCherry等荧光蛋白，用于后续实验中。

2.体外转录cRNA

大提扩繁的A-pNB1-mCherry质粒先进行酶切线性化；线性化后的质粒纯化后，使用T7体外转录试剂盒（mMESSAGE，Invitrogen），转录获取cRNA；利用试剂盒配套的DNaseI 消化DNA模板，并用LiCl法纯化cRNA，除盐；

3.显微注射cRNA

（1）获取非洲爪蟾的卵细胞，利用30 mg/ml collagenase D (Roche) 酶解（22℃，1-1.5h）去除卵细胞表面的囊膜；

（2）挑选IV-VI期，即成熟卵细胞，使用显微注射系统，注入cRNA：

Control：30nl H2O (Nuclease-free) / cell A: 30nl / cell

（3）注射后卵细胞在Ringer 溶液中孵育36h，16℃，及时剔除死卵，更换新鲜溶液

4.荧光表达检测

利用荧光共聚焦显微镜（Leica SP8 Laser confocal microscope (Leica, GER)）检测蛋白表达情况。GFP荧光使用512 nm激光激发，mCherry 荧光使用546 nm激光激发。

5.电压钳检测A蛋白激酶影响K离子通道，数据统计

ControlKAT1组KAT1+A组

结论：A蛋白通过和KAT1的作用进而抑制钾离子通道。

6.电压钳检测1-9种溶液对A受体蛋白的影响，数据统计

空白组A组

针对上述2组卵母细胞进行9种溶液的灌流，统计电流。

结论：4和8号溶液明显有电流产生，表示A蛋白可能是4和8号溶液的受体蛋白。

电压钳技术还可以检测更多其他蛋白和蛋白之间的作用，我们也做了很多种类，此处就不再一一列举，希望大家有所了解后，可以在研究中充分利用此技术，结合其他蛋白互作、蛋白磷酸化等技术，更加充分的阐述相关作用机制。

温馨提示：通过以上关于爪蟾卵母细胞中电压钳检测通道蛋白和受体蛋白电流变化服务内容介绍后，相信大家有新的了解，更希望可以对你有所帮助。