紫外线对枯草芽孢杆菌的影响(通过紫外线诱变法获得枯草芽孢杆菌)

导语：紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应——万融实验

【实验目的】

（1）掌握紫外线诱发微生物突变的基本原理。

（2）学习微生物菌种诱变筛选的方法。

【实验原理】

基因突变可分为自发突变和诱发突变。诱发突变简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因突变频率的手段。凡具有诱变效应的任何因素都称为诱变剂。紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变剂。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。对于紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶进行修复，它能使胸腺嘧啶二聚体解开，恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行，并且将照射处理后的微生物放在暗处培养。本实验以紫外线作为诱变因素，采用透明圈法观察淀粉酶产量，以透明圈直径与菌落直径的比值作为指标判断诱变效应。

【实验器材】

1．菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2．培养基淀粉培养基、LB液体培养基。

3．试剂碘液、无菌生理盐水等。

4．仪器和用具无菌吸管、玻璃涂棒、血球计数板、显微镜、紫外灯（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、振荡混合器等。

【实验步骤】

1．菌悬液的制备取培养48h的枯草芽孢杆菌斜面，用10mL左右的无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入一支无菌大试管中。将试管在振荡混合器上振荡30s，以打散菌块。离心（3000r/min）10min，弃上清液。用无菌生理盐水将菌体洗涤两三次，制成菌悬液。用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为108个/mL。

2．平板制备将淀粉培养基融化，倒平板27套，凝固后待用。注意：每个平板背面要事先标明处理时间和稀释度。

3．紫外线处理紫外灯照射距离为30cm，照射前打开预热约20min。取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3mL，并放入一根无菌搅拌棒或大头针。将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，分别搅拌照射1min和3min。盖上皿盖，关闭紫外灯。注意：照射计时从开盖起，加盖止。先开搅拌器开关，再开盖照射，使菌悬液中的细胞接受照射均匀等。

4．稀释用10倍稀释法把经过照射的菌悬液用无菌水稀释成10-6～10-1。

5．涂布平板取10-4、10-5和10-6三个稀释度涂布平板，每个稀释度重复3个平板，每个平板加稀释菌液0.1mL，用无菌玻璃涂棒均匀地涂满整个平板表面。以同样的操作，取未经紫外线处理的菌液稀释液涂布平板，作为对照。注意：从紫外线照射处理开始，直到涂布平板的所有操作步骤都应避光进行。

6．培养将上述平板用黑色的布或纸包好，于37℃培养48h。

7．计数将培养好的平板取出，进行细菌计数。根据对照平板上的菌落数，计算出每毫升菌液中的细菌数。同样计算出紫外线处理1min和3min后的细菌数及致死率。

8．观察诱变效应选取菌落数在五六个左右的处理平板，观察诱变效应。分别向平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。测量透明圈直径与菌落直径，并计算其比值，与对照平板相比较，说明诱变效应，并选取比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面菌株可作复筛用。

【实验报告】

1．实验结果

（1）菌落计数将紫外线处理前后平板菌落计数填入下表。

表13-1　紫外线处理前后平板菌落计数

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（2）诱变致死率根据以下公式计算诱变致死率，并将计算结果填入表13-2。

表13-2　紫外线诱变致死率

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（3）诱变效果将紫外线诱变前后产淀粉酶能力的结果填入下表。

表13-3　紫外线诱变前后产淀粉酶能力比较

2．思考题

（1）用紫外线处理筛选突变株时应注意什么？

（2）死亡率和突变率之间有何联系？（程东庆）

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