da测序和物理图的区别(da测序和物理图有关系吗)

导语：DNA测序和物理图

现代DNA技术源于sanger法，它使得测定人类基因组几乎3亿个碱基对的碱基序列成为可能。

1. Sanger链末端终止测序法

最初的测序方法首先需要将DNA克隆到载体中，如M13噬菌体载体或者噬菌体，以便产生单链DNA。而现在通过加热的方法就可以从双链DNA产生单链DNA开始测序。然而将一段长约20bp的寡核苷酸引物与单链DNA杂交，该引物设计成能够与载体多克隆位点相邻的一段序列杂交，并且其3’端朝向多克隆位点处的插入片段。

用DNA聚合酶I的Klenow片段延伸引物，合成与插入片段互补的DNA，Sanger法的关键是DNA合成反应分别在4个试管中独立进行，且每管各有一种不同链终止剂，链终止剂是一种双脱氧核苷酸，其本身不允许DNA合成，所以必须加入过量的脱氧核苷酸和足够的双脱氧核苷酶以便随机终止DNA链的延伸。每个管里的双脱氧核苷酸都不同，有的是ddATP，有的是ddACP等等，同时每个管里都有放射性dATP，这样DNA产物就有放射性了。这样每个管里都产生了长度不等的片段，接下来将四组产物在变性条件下在高分辨率聚丙烯酰胺凝胶的平行泳道内电泳，每个产物都是单链的，在胶片上以平行的方式显示出来。

2. 自动化DNA测序

上述这种类似于手动测序的技术十分有效，但是仍然相对较慢，如果要测定非常大的DNA，就需要快速自动化的测序方法，在sanger测序法的基础上，对4组反应的双脱氧核苷酸分子分别用荧光分子标记，每个试管的产物在光激发下会发出不同颜色的光，在延伸反应和链终止完成后，将全部4组反应物混合，在一个短的细柱内的同一泳道进行凝胶电泳，凝胶底部附近有一个分析器，可用激光束激发所通过反应混合物，这些信息被转化成碱基序列并被储存在计算机中，而每种颜色峰图的高度表达条带通过激光束时产生的荧光强度。

3. 高通量测序

高通量测序通常产生相对较短的序列，或从测序装置的一次运行所获得的连续序列，Sanger测序一般产生500碱基以上的长序列，而高通量测序一般产生25-35个碱基或200-300个碱基，以参考序列为引导进行拼接。

20世纪90年代报道了一种高通量测序，叫做焦磷酸测序，该测序具有速度和准确性上的巨大优势，且不需要电泳，其原理是允许DNA聚合酶I复制待测定的DNA，并实时地在每个核苷酸掺入时进行测序，每个核苷酸的掺入会释放一个焦磷酸（PPi），将焦磷酸与光的产生偶联起来就可对其进行定量测定。由每个脱氧核苷酸掺入所产生的光激发电荷耦合元件照相机，该相机 将信号发送给计算机，由计算机产生一个热解图。其不足之处在于每个只能进行200-300nt的阅读，之后序列的准确性就不可接受性地降低了，但其在检测某位点突变，或者在染色质免疫沉淀测序，鉴定转录因子结合位点中则是非常有用的。

4. 限制图

在对大的DNA片段进行测序之前，一般需要初步绘制一张图谱，对DNA分子上的标记进行定位，这些片段不是基因，而是一小段DNA序列，如限制酶的酶切位点的空间排列顺序，绘制限制图的一个主要策略是用两种或两种以上的限制酶分别酶切所研究的DNA，然后测定每个酶切片段的大小，再用另一种限制酶切割这些酶切片段，用凝胶电泳分别测定第二次酶切片段的大小，并与另一种被标记的酶切片段进行southern印迹，由此至少可以确定一些识别位点与其他识别位点的相对位置。

Ref:《分子生物学》Robert F · Weaver著

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