上海交大合作通过靶向敲入翻译增强子实现精准的水稻抗病抗逆育种

导语：上海交大合作通过靶向敲入翻译增强子实现精准的水稻抗病抗逆育种

背景介绍

近年来，通过基因编辑技术优化内源基因的时空表达特性正成为一种重要的育种方式。对于靶向转录调控而言，一系列CRISPRa、CRISPRi转录调控工具可以实现有效的转录增强或抑制；而大规模的启动子定向突变及筛选也已经在作物精准育种领域展示出巨大的潜力。在翻译层面，由于对翻译调控机制缺乏深入的研究，靶向翻译调控工具尚未得到很好的开发。

2023年3月31日，上海交通大学陆钰明教授团队与南方科技大学朱健康院士团队合作在Frontiers in Plant Science（IF：6.627）在线发表了“ Targeted insertion of regulatory elements enables translational enhancement in rice”的研究论文。该研究通过在水稻中靶向敲入翻译增强子，在不改变内源基因转录水平的情况下实现了靶向翻译上调，通过靶向翻译增强OsWRKY71或OsSKC1基因，提高了水稻对生物胁迫或非生物胁迫的抗性。在原生质体报告系统中，翻译上调水平最高可达10.4倍；在内源基因位点上，翻译增强水平可达2.8倍，且增强效果在后代中仍稳定。同时，研究团队发现，翻译增强子在不同的启动子或基因背景下，增强效果存在差异，推荐在进行育种应用前优先利用原生质体报告系统进行快速验证。

水稻原生质体系统高效筛选翻译增强子

首先，研究团队在水稻原生质体中通过双荧光素酶报告系统筛选了一系列翻译增强元件。结果显示，紫花苜蓿花叶病毒中的翻译增强子（AMVE）具有最好的翻译增强效果，最高实现8.5倍的增强；同时，研究团队也鉴定到来源于水稻内源乙醇脱氢酶基因（OsADH）的增强子（ADHE）也可以实现高效的翻译增强，翻译增强效果可达4.3倍。同时，研究人员进一步检测了其mRNA水平，发现在原生质体报告系统中引入翻译增强子，不影响报告基因的转录水平。初步证实靶向敲入翻译增强子可以实现不影响基因转录水平的翻译上调。

图1. 在水稻原生质体系统中筛选翻译增强元件

原位靶向敲入翻译增强子实现水稻精准育种

与转录调控不同，翻译增强检测依赖基于抗体的免疫印记，研究团队挑选了水稻的OsWRKY71转录因子进行相关研究。该转录因子参与诱导水稻H2O2的产生，提高水稻抗病性；同时该基因具有很好的商业化抗体，适合验证翻译增强效果。研究人员首先将OsWRKY71启动子替换双荧光素酶报告系统pDLUC02载体上的35smini，并在预设靶点处融合AMVE或ADHE翻译增强子，水稻原生质体实验验证显示，该报告基因蛋白水平分别实现了平均5.8倍和2.9倍的上调。

随后，研究人员对水稻内源的OsWRKY71基因进行靶向敲入验证，在60株T0植株中检测到11株AMVE正向敲入材料，并在其中挑选3株精准的单个元件无缝敲入材料进行后续研究。对T1代纯合子代进行mRNA水平及蛋白水平的检测发现，内源WRKY71基因的转录水平无显著上调，但蛋白水平实现了最高2.8倍的上调；此外，对T1代植株对于白叶枯病的抗性也显著强于野生型。该发现进一步验证了翻译增强子在水稻抵抗生物胁迫育种应用中的前景。

图2. 靶向翻译增强WRKY71实现水稻抗病育种

水稻内源SKC1作为Na+/K+转运蛋白，参与水稻的耐盐胁迫。研究人员首先在原生质体中，以SKC1基因启动子背景下检测了AMVE及ADHE增强子的表现，发现其中AMVE效果更好，可实现10.4倍的翻译增强。进一步，研究团队对内源的SKC1基因进行靶向敲入验证，转化共获得119株材料，在其中正向敲入的32株材料中挑选3株无缝的单个元件敲入材料进行进一步验证。结果显示，靶向敲入AMVE翻译增强子在不影响SKC1基因的转录水平的同时，提高了水稻的对于盐胁迫的耐受性。靶向敲入翻译增强子的T2代材料相比于野生型，在150mM持续盐处理7天的条件下具有更高的存活率（65% vs. 45%）；也表明翻译增强效果在后代中仍然能够稳定遗传。该发现进一步显示了靶向敲入翻译增强子在应对非生物胁迫育种中的应用价值。

图3. 靶向翻译增强SKC1实现水稻抗盐育种

总结

总的来说，该研究通过筛选了一系列翻译调控元件，筛选到一个具有广谱性的翻译增强子AMVE。将AMVE靶向敲入到WRKY71和SKC1的5‘UTR中，成功地提高了蛋白丰度，实现了预期的作物性状改良。这是首次利用翻译增强子对靶基因进行位点激活，为操纵蛋白质翻译提供了新的策略。随着基因组编辑技术的发展，通过调控元件编辑介导的位点基因激活将变得越来越容易，使该策略成为一种有用的育种方法。同时，该研究也发现，翻译增强子在不同基因或启动子背景下增强效果具有差异。由于基因的翻译效率受到温度、UTR长度以及mRNA二级结构等多种因素的影响；因此，在育种应用时，推荐先在原生质体中进行快速验证。