黏性末端的连接方式(黏性末端的连接的优缺点)

导语：黏性末端的连接

【实验目的】

（1）掌握黏性末端连接方法的原理。

（2）掌握采用黏性末端连接法将外源DNA装入载体的方法和操作步骤。

【实验原理】

在pH7.5～7.6、Mg2+和ATP存在的条件下，将经酶切的载体分子与外源DNA分子连接起来，成为1个重组DNA分子。连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶等。其中T4噬菌体DNA连接酶既可连接黏性末端，又可连接平末端。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但考虑到黏性末端形成的氢键在低温下更加稳定，一般在连接黏性末端时，反应温度可用10～16℃。反应时间根据各种连接酶的活性确定，目前大部分市场化的连接酶连接时间在1～12h。

本实验使用T4噬菌体DNA连接酶，将经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化并回收纯化得到的pET28（a）质粒线性DNA片段和λDNA片段进行重组连接，使学生掌握黏性末端的重组连接方法。

【实验材料、试剂及仪器】

1．实验材料

经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化并回收纯化的pET28（a）质粒线性DNA片段、λDNA双酶切消化回收片段。

2．实验试剂

（1）T4连接酶。

（2）10×T4连接酶缓冲液。

（2）无菌水。

3．实验仪器

生化培养箱（全班1台）

制冰机（全班1台）

冰盒（每2人1个）

0.5mL无菌离心管（每人1支）

移液器（每2人1套）

10μL无菌吸头（若干）

台式低速离心机（每8人1台）

【实验步骤】

1）在0.5mL离心管中加入（反应体系20μL）：

λDNA酶切回收产物 10μL

pET28（a）质粒酶切回收产物1μL

10×T4连接酶缓冲液 2μL

T4连接酶 1μL

无菌水 6μL

（2）3000r/min短暂离心混匀，16℃连接2～4h或过夜。

【实验注意事项】

同实验27“实验注意事项”（1）～（3）。

【实验讨论】

问题：PCR产物和载体DNA的量如何确定？

答：在进行克隆时，载体DNA和外源插入DNA片段的物质的量之比一般为1∶2～1∶10。

【参考文献】

［1］萨姆布鲁克．分子克隆实验指南．金冬雁等译．第2版．北京：科学出版社，1993.

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