小脑颗粒细胞的培养方法(小脑颗粒细胞的培养特点)

导语：小脑颗粒细胞的培养

简介

将4~8只新生鼠的小脑切成小立方块，放入HBSS，在37°C条件下用胰蛋白酶消化15 min。将细胞接种于涂有L-多聚赖氨酸的培养皿或培养瓶。

原理

将4~8只新生鼠的小脑切成小立方块，放入HBSS，在37°C条件下用胰蛋白酶消化15 min。将细胞接种于涂有L-多聚赖氨酸的培养皿或培养瓶。

操作方法

材料与仪器

DMEM HBSS L-多聚赖氨酸阿糖胞苷0.025%胰蛋白酶硅酮 P e tr i培养皿解剖刀解剖剪解剖镊Pasteur吸管10ml吸管试管水浴箱

步骤

1. 在无菌条件下切除小脑，放入HBSS（含有3 g/L BSA）。 2.用解剖刀将脑组织切成约0.5 mm3大小的立方体。 3.将组织块移入12 ml试管，用HBSS洗3次。每次洗涤后让组织块沉到试管底部。 4.加入10 ml用HBSS配制的0.025%胰蛋白酶（用HBSS配制），在37°C条件下用水浴箱孵育15 min。 5.将胰蛋白酶消化的脑组织移入50 ml离心管，然后加入20 ml生长培养液，以终止胰蛋白酶的消化作用。 6.通过用硅化的Pasteur吸管研磨使组织分散，直至获得单细胞悬液。 硅化Pasteur吸管： (a)用超纯水将硅酮液稀释为0.1%~1%； (b)将吸管浸人硅酮液或用硅酮液冲洗吸管内面； (c)放置24 h晾干或在100°C条件下放置几分钟使吸管变干； (d)将吸管干热灭菌。

用L-多聚赖氨酸处理培养皿： (a)用超纯水溶解L-多聚赖氨酸（10 mg/L）； (b)将混合物过滤除菌； (c)每个35 mm Petri培养皿内加入1 ml L-多聚赖氨酸液； (d)10~15 min后吸出L-多聚赖氨酸液，加入1~15 ml培养液； (e)将培养皿在培养箱内放置2 h以上，至细胞接种。 7.将盛有细胞悬液的离心管放3~5 min，让小的组织团块沉到试管底。然后，用Pasteur吸管吸出组织团块。 8.将单细胞悬液离心（200 g，5 min)后，吸出上清液。 9.用生长培养液混悬细胞团，然后接种细胞，每个培养皿的细胞密度为2.5×106~3.0×106个。 10.培养2~4 d后（两天后最佳），加入5~10μmol/L阿糖胞苷，继续培养24 h。 11.用DMEM（含有30 mmol/L葡萄糖、2 mmol/L谷氨酰胺、24.5 mmol/L氯化钾、100 mU/L胰岛素（Sigma，Ⅰ-1882）、7μmol/L对氨基苯甲酸（Sigma，A-3659）、100μg/ml庆大霉素和10%加热灭活的FCS）换液。

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