细胞凋亡过程中检测da断裂的常用方法是(细胞凋亡da断裂)

导语：常用细胞凋亡检测方法-DNA片断化检测

细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

1、大分子染色体DNA片段的测定

细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300 kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的50~300 kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。

参考文献 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

2、 DNA Ladder 测定

收获细胞（1X107）沉淀→细胞裂解液裂解细胞→13000 rpm 离心5 min, 收集上清→1% 加入SDS和RnaseA（5 mg/ml）→56°C，2h→蛋白酶K（2.5 mg/ml）37°C，2h→1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4℃过夜→14000 rpm离心15 min→最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer→1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。

参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507。

凋亡细胞DNA ladder示意图

3、凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析

收集细胞→70%冷乙醇（in PBS）4℃固定过夜→PBS洗涤，1000 rpm离心10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37℃消化30 min→PI（50 mg/ml）染色，室温避光15 min→FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

PI染色流式分析凋亡

4、ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)

优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。

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