用于基因克隆过程的受体细胞应具备哪些条件(克隆感受态细胞和表达感受态细胞)

导语：基因克隆：高效感受态细胞制作

实验·原理

通过电击法或CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂处理，使细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。RbCl法制备的感受态细胞转化效率较高。

实验试剂· 器材

试剂

MnCl2HEPESCaCl2SOB培养基SOC液体培养基液氮

器材

水浴锅三角瓶玻璃瓶冷冻离心机滤膜离心管称量天平

操作方法

一、LB培养基配制（固体培养基加2%琼脂粉）

酵母粉YeastExtract

5g

蛋白胨Peptone/g

10g

NaCl

10g

水

1000ml

二、TFBI溶液配制

RbCl(氯化铷)

5g

1M KAc(醋酸钾)

12.3ml

1M CaCl2(氯化钙)

4.1ml

1M MnCl2(氯化锰，粉色)

20.5ml

glycerol(甘油)

61.5g

0.1M HAc(醋酸)

8ml 调节pH至5.8

超纯水

补足至410ml

配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌

三、TFBII溶液配制

1M MOPS（pH6.5，溶液为黄色)

1.5ml

1M CaCl2(氯化钙)

11.25ml

1M RbCl

1.5ml

glycerol(甘油)

22.5g

1M KOH(氢氧化钾)

调节pH至6.5

超纯水

补足至150ml

配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌

四、高效感受态细胞制备

1. 取实验室-80℃保存的DH5α菌种在无抗性的LB平板上划线，37℃培养过夜，进行活化；

2. 从LB平板上挑取单菌落，尽量选择菌落较饱满，边缘平滑，个头较大、长势较好的菌落；

3. 挑选上述单菌落接种于装有10ml无抗性LB液体培养基的25ml锥形瓶中；

4. 37℃下振荡培养过夜（摇床转速 200rpm，12h左右），进行充分活化；

5. 将上述菌液以1:100的比例接种到大的锥形瓶中，37℃振荡培养2～2.5h（尽量不要超时），至OD590达0.4~0.6；

6. 将培养好的菌液转入洁净无菌的50ml离心管中，冰上放置10min（此时，可以将配置好的TBFI溶液冰浴预冷，离心机预冷至4℃，如果离心机降温较慢，最好再提前一点）；

7. 在4℃下，4000rpm离心10min，弃去上清；

8. 加入初始细菌培养基1/2.5的冰上预冷的TBFI溶液（如果前面使用的是60ml，这里则为60/2.5=24ml），轻轻悬浮细胞，冰上放置10min；

9. 4℃，4000rpm离心10min，弃去上清；

10. 加入初始细菌培养基1/25体积的预冷TBFII（如果前面使用的是60ml，这里则为60/25=2.4ml，也即为TBFI的1/10，当然具体体积也可以根据个人经验上下变动），轻轻悬浮菌沉；

11. 分装至EP管中，每管分装100μl（EP管最好预冷，分装过程要求在冰上进行）。

12. -80℃冰箱长期保存，定期活化，有利于长期保存。（保存中不要断电，否则细胞可能失活）。

[ 特别提示 ]

-80℃冰箱储存的感受态细胞在6-8周后，转化率很快降低，可用已知标准及浓度的闭环质粒鉴定感受态细胞的转化能力。

免责声明:本站部份内容由优秀作者和原创用户编辑投稿，本站仅提供存储服务，不拥有所有权,不承担法律责任。若涉嫌侵权/违法的，请反馈，一经查实立刻删除内容。本文内容由快快网络小舻创作整理编辑！