土壤微生物的分离纯化方法及无菌操作技术(土壤中微生物分离纯化)

导语：土壤微生物的分离纯化及菌落观察——万融实验

【实验目的】

（1）掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。

（2）了解四大类微生物的菌落特征。

【实验原理】

土壤是微生物生活的大本营。土壤中的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化到许多有用的菌株。在土壤中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。其基本原理主要包括两个方面：一是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂，造成只利于待分离微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物；二是微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。单个菌体经生长繁殖，在固体培养基表面生成成堆的细胞群，称为菌落（colony）。不同微生物的菌落具有不同的特征，是形态分类的指标之一。细菌菌落一般呈湿润、光滑、较透明、较黏稠、易挑取等特点；放线菌菌落一般呈干燥、不透明、致密、难挑取等特点；酵母菌菌落一般较湿润、光滑、黏稠、易挑取，比细菌菌落大且厚，多呈乳白色，少数呈红色；霉菌菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈绒毛状、棉絮状等，菌落正反面颜色不同。

【实验器材】

1．实验材料菜园土壤。

2．培养基高氏1号琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基。

3．试剂10％酚、链霉素、无菌水等。

4．仪器和用具无菌玻璃涂棒、无菌吸管、无菌培养皿、盛9mL无菌水的试管、盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。

【实验步骤】

1．稀释涂布平板法

（1）倒平板

1）分别将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化。2）待培养基冷至55～60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液（使每毫升培养基中含链霉素30μg）。3）倒平板，每种培养基倒三皿，其方法如图2—7所示。

（2）制备土壤稀释液

1）称取土样10g，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，并使细胞分散。2）用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。3）以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液（图9—1）。注意：每一稀释度换一支无菌吸管。

图9-1　制备土壤稀释液（引自沈萍）

（3）涂布平板

1）每种培养基的三个平板底部分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀释度。2）用三支1mL无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各吸取0.2mL对号放入已写好稀释度的平板中。3）用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。

（4）倒置培养1）将高氏1号琼脂培养基平板和马丁氏培养基平板置于28℃恒温培养箱中培养3～5d。2）将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板置于37℃恒温培养箱中培养1～2d。

（5）挑菌接种将培养后长出的单个菌落分别挑取、接种到斜面培养基上，适温培养，待菌苔长出后，用显微镜涂片检查是否是单一的微生物。若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。稀释涂布平板法的操作流程如图9-2所示。

图9-2　稀释涂布平板法的流程图（引自M．T．马迪根）a．将样品滴加到平板表面；b．用无菌涂棒把样品均匀涂布到平板表面；c．平板倒置培养；d．典型的涂布平板结果

2．稀释混合平板法

此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先分别吸取0.5mL10-4、10-5、10-6稀释度的土壤悬液对号放入平皿，然后再倒入溶化后冷却到45℃左右的培养基，边倒入边摇匀，使样品稀释液与培养基混合均匀，待冷凝成平板后，分别倒置于28℃或37℃培养箱中培养，再挑取单个菌落，直至获得纯培养。流程如图9-3所示。

图9-3　稀释混合平板法的流程图（引自M．T．马迪根）a．将样品滴加到已灭菌的培养皿中；b．加入无菌的培养基与样品充分混合；c．平板倒置培养；d．典型的混合平板法结果

3．平板划线分离法

（1）倒平板同上。（2）划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线（图9-4）。划线完毕，盖上皿盖，倒置于适温下培养。

图9-4　平板划线示意图（引自M．T．马迪根）a．在平板培养基的一边做第一次平行划线三四条；b．转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平行划线；c．用同法通过第二次平行划线部分做第三次平行划线；d．用同法通过第三次平行划线部分做第四次平行划线；e．用同法通过第四次平行划线部分做第五次平行划线（3）挑菌从划线分离平板上挑取单菌落（图9-5），直至获得纯培养。

图9-5　划线获得单菌落（引自M．T．马迪根）4．辨认菌落通过以上平板涂布或平板划线，可在相应的平板上获得细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落。观察这些菌落的形态特征，并将记录结果。

【实验报告】

1．实验结果

（1）平板分离结果记录三种培养基平板上长出的菌落分属于哪个微生物类群。

（2）菌落形态特征将四大类微生物的菌落的形态特征填入表9-1中。

表9-1　四大类微生物菌落形态特征比较

2．思考题

（1）在平板划线法中，为什么每次都需将接种环上的剩余物烧掉？

（2）为什么要将培养皿倒置培养？

（3）为什么高氏1号琼脂培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？

（陈　敏）

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