高效液相色谱法原理(高效液相色谱法的优缺点)

导语：高效液相色谱法

液相色谱法是一种以液体为流动相的柱色谱分离与分析技术。相对以气体为流动的气相色谱而言，以液体作为流动相的任何一种色谱过程均为液相色谱。由于液相色谱法高效、快速，之后的到了迅速发展，在经典的液相柱色谱法的基础上，吸收了气相色谱法等的理论和实践技术，并采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏检测器等装置，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种柱色谱技术成为高效液相色谱法，又成为高压液相色谱法。

高效液相色谱法具有以下突出特点：高压、高速、高效、高灵敏度、应用广泛。

柱外效应：是指色谱柱以外的引起色谱峰变宽的各种因素，如流动相在管壁附近的流速不如在管中心的流速快，就会引起峰的拓宽，尤其使用小内径色谱柱时，柱外效应更明显。色谱峰展宽包括柱前锋展宽和柱后峰展宽。柱前峰展宽主要是由进样和进样器连接管死体积引起的，进样时液流的扰动和连接管的死体积会引起色谱峰的变宽和不对称，所以样品最好直接进到柱头的中心部位。柱后展宽主要是由检测器流通池体积及其连接管等引起的，采用小体积检测器可以降低柱外效应，一般，柱外管道的半径为2~3nm或更小。 总之，要减少柱外效应，要尽可能减小柱外死体积，如采用零体积接头来连接各个部件。

高效液相色谱仪

流动相的差异决定了液相色谱仪和气相色谱仪的不同。高效液相色谱仪包括高压输液泵、梯度淋洗装置、进样装置、色谱柱、检测器和记录系统等主要部件。工作流程如下图：储液器中储存的流动相经过高压泵送到色谱柱冲洗柱子，当柱子平衡而且基线平直后，试样通过注射器进入进样器，然后由流动相把试样送到色谱柱进行分离，分离后的组分由检测器检测，输出的信号通过放大器放大后用记录仪记录下来。

高效液相色谱仪工作流程图

1、高压输液泵 高压输液泵是用来输送流动相的，它是高效液相色谱仪的重要部件，应具备以下的条件，流量稳定、有较高的输出压力、能抗化学腐蚀、泵的死体积小、操作与维修方便

2、梯度淋洗装置 对于某些复杂的样品，采用等度洗脱时往往不能满足要求，采用梯度洗脱，即可在分离过程中，组成流动相的是两种或两种以上的不同的溶剂，按一定程序连续改变配比、极性、PH值和离子强度，从而达到提高分离效果和分析速度的目的。

3、进样装置 进样装置的作用是把分析样品有效地送入色谱柱中进行分离。由于高效液相色谱柱子较短，固定相颗粒较细，进入柱中的样品在流动相中扩散越迅速，则色谱法峰越宽，因此，进样时要求样品在到达柱头前，不与流动相混合，直接注射到柱头中心即所谓“点进样”。进样方式通常有：隔膜进样、停留进样、阀进样和自动进样等。

4、色谱柱 色谱柱是色谱分离的核心，分离效果的好坏主要决定于色谱柱的性能。通常采用填充柱，即按一定的方法把固定相填入柱中，色谱柱由色谱柱管和填充的固定相组成，固定相色谱分离的关键部分，对色谱柱管的要求是耐高压、耐腐蚀。一般采用厚壁的玻璃管或内径经过抛光（提高色谱柱的分离效果）的不锈钢制成。

5、检测器 高效液相色谱对检测器的要求是灵敏度高、重现性好、线性范围宽、噪声低、定量准确、对温度和流量的变化不敏感，衡量检测器性能的一些指标一般仍沿用气相色谱检测器的表示方法。高效液相色谱检测器分为两类：一类是通用型检测器，它对试样和流动相总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光检测器和电导检测器。这类检测器使用范围广，但是由于它对溶剂（流动相）也有响应，因此易受温度、流量变化的影响，造成较大的噪声和漂移，不能用于梯度淋洗，灵敏度较低，不适于衡量分析。另一类是选择性检测器（溶质性检测器），它仅对被分离组分的物理或化学性质有响应，对流动相无影响或响应很小，如紫外吸收检测器和荧光检测器等都属于这一类。

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