导语：干货分享 | 如何铺出漂亮的细胞板？铺板成功的关键在于？

细胞铺板大概是细胞实验中最常见又必须掌握的一门技术，看起来是非常简单的一项操作，但其实也不是那么好做的，有很多人不是很得要领，经常会遇到细胞中间密或者中间稀疏等“细胞分布不均匀”的情况。

如下图为：细胞铺板时，常出现的细胞分布不均匀现象。

要知道把用于实验的细胞铺的均匀且密度适宜，不仅看起来赏心悦目，更是决定了后续实验的成败（细胞聚集导致的接触抑制现象使实验数据的可信度大打折扣）。

小编也是历经多次失败后，才发现原来细胞铺板是有规律可循的，今天就和大家聊一聊：「细胞铺板」技巧。

细胞铺板实验

主要分为3大步骤：收集细胞→细胞计数→细胞铺板。

一、收集细胞，制作单细胞悬液

贴壁细胞需要将细胞消化收集，消化后的细胞一定要充分混匀，要把聚在一起的细胞团充分地吹打开，最好是单个的状态，但同时又不能损伤细胞。

这里需注意：

消化细胞需要选择适用的消化液、适当的消化温度和时间。建议新手或者养的是一个新细胞时，自己要观察最佳胰酶消化时间及浓度。消化后需要轻轻拍打细胞贴壁面，震落细胞。一般用1000rpm/min离心即可，离心力太大细胞容易抱团！离心后，要充分悬浮！悬浮离心后的细胞团时，先不要把所有液体都加进去！一般先加2mL液体，然后用1mL移液器轻轻将细胞吹起（注意不要有气泡），细胞要像云雾一样散开，这样易于形成单细胞。此外，吹散次数过多也会影响细胞活力，所以要熟练操作，尽快上板。

二、细胞计数

取10 微升加4%台盼蓝计数活细胞。这里不做详细介绍。

三、细胞接种

需要根据实验目的选择不同规格的培养板。如在进行药物对待测细胞半抑制率（IC50）测试时，通常使用96孔板，一方面可以设置浓度梯度；另外还可一次性测多个药物，减少实验误差。

① 稀释细胞：根据细胞计数结果后，将细胞稀释到目的浓度。

获得细胞悬液后要先根据选择的培养板的种类，以及要种的细胞密度调整细胞悬液的浓度，可在离心管中调整后反复颠倒摇匀，种板需要一步完成，切不可先加细胞后补液或先加液再补细胞。

tip：细胞密度对于铺板很重要，过密很容易造成细胞居中，细胞浓度过稀会造成细胞难以生长起来。一般进行预实验。

② 加入细胞悬液

（1）铺6孔板，12孔板或24孔板

为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象，通常在每一个孔加少量的无血清培养基，不用太多，浸润孔底即可。一般可加一个孔，浸润，再用移液枪移取，再加入第二个孔，浸润，依此类推。

如果培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细胞容易聚集，可以多加点液体缓解。

然后加入细胞悬液，从孔的左边靠近底部贴壁慢慢加入，这样加液后，细胞悬液会平铺在整个孔底，细胞分散较均匀，可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象。

细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。如果有抱团的话，用手指从底部轻轻敲打，使之分散。也可以用平板振荡器稍稍振荡一下。

接下来，将板放在水平板面上“十字”形摇匀（上下左右四个方向进行移动，呈十字形状，重复5-6次），这一步很重要！不可以转圈摇，因为细胞会被带到中间。摇匀后要放工作台静置一下，等细胞贴壁了，轻轻移入到培养箱中。

（2）铺96孔板

可用排枪，速度非常快。每孔加入100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部缓慢加入（加样过快容易导致细胞聚集）。加完半边板48孔后，将剩下的未加的细胞悬液再混一下，再继续加剩余的半边板子。

加完所有的时候，盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度，敲三次即可，太大力或次数太多会导致细胞集中成堆。将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，然后静置约5min，放置培养箱。

注意事项：

★ 用排枪吸取时，一定要保证每个枪头吸上来的悬液体积一致。

★ 如果是用于进行MTS等长时间测试时，最外圈应空余出来（中间60孔为最佳，四周的一圈边缘孔不接细胞），加入PBS或细胞悬液（做空白或阴性对照），以防止培养基蒸发引起的边缘效应。

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